2017 年 5 月 30 日，《自然·方法》（Nature Methods）刊登了一篇文章。来自哥伦比亚大学等机构的研究人员发现，在治愈小鼠相关疾病遗传性疾病的同时，基因编辑常用的工具 CRISPR/Cas9 可能会造成很多意料之外的基因突变。

文章刊登后引发了十分广泛的关注。一方面，CRISPR/Cas9 作为最有效的基因编辑工具之一，已经广泛应用到各类研究中。另一方面，中国已经开始利用该基因编辑技术的临床试验。

图丨相关研究报告已于5月30日发表在《自然·方法》官方网站上

CRISPR 到底是否会带来意想不到的副作用？有人认为，CRISPR 作为本世纪最伟大的技术之一，其缺陷被人为忽视了。而也有人认为，论文中提到的实验用小鼠并不是好的研究对象，其得出的数据是片面的，缺乏可靠性。

为此，DT君专门采访了上海科技大学研究副教授刘佳博士。刘佳博士的研究方向为用基因编辑技术的改进和应用。以下是经过整理后的采访内容：

问：这篇论文是以什么形式发表的？

刘佳：这篇文章是以 correspondence 的形式发表在《自然·方法》（Nature Methods）上，correspondence 这种形式可以翻译成研究者投稿。与其他类型的文章（Brief Communications 或 Articles）相比，correspondence 不强调研究的系统性，而强调时效性，有时候不够全面。

《自然·方法》设置这个栏目的宗旨就是能及时分享给大家有用的信息，哪怕相关信息不够全面。

问：目前有学者批评这篇文章有对照组设置不全等缺陷，请问您如何评论？

研究性质的 correspondence 仍然需要同行评议，而且《自然·方法》也是高水平的杂志，所以数据可靠性和学术上的价值很可能还是可靠的。

问：这篇文章到底说了什么？

刘佳：这篇论文非常简洁，如果翻译出来篇幅也不长。文章内容在第一段已经把主题说得很清楚，就是大家之前在分析 CRISPR/Cas9 的脱靶效应的时候，考虑的可能不是那么全面，需要更加重视全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）的作用。

基因编辑中出现的脱靶包括不同的形式，例如单核苷酸差异（single-nucleotide variants，SNVs），以及核苷酸的插入与缺失（insertionsand deletions, indels）。

从技术上来说，文章通过显微注射技术将 Cas9 核酸酶蛋白质、单链寡聚脱氧核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotides, ssODN）模板注射到小鼠的受精卵（zygotes），建立起杂合的亲代小鼠。研究者采用全基因组测序（WGS）分析了由亲代小鼠繁殖出的子代小鼠的突变情况。

通过和对照（未经过基因编辑）小鼠比较，基因编辑小鼠出现了更多“脱靶”的Indels和SNVs。同时，这些 SNVs “脱靶”位点和设计的 sgRNA 具有较低的同源性，因而很难被传统的方法预测到。

之前的研究中，大家常常用全外显子测序的方法检验CRISPR/Cas9 是否影响了基因组的其他位置。从某种意义上来说，全外显子测序只检查编码蛋白的部分。另外，虽然也有科学家使用WGS检测动物上的“脱靶”效应（例如文章中所引用的参考文献3），但传统检测手段更关注于 “脱靶”效应引起的核苷酸插入与缺失（indels），而不是单核酸突变（SNVs）。

而在这篇文章中，作者表示，他们使用了全基因组测序的方法后，发现了一些以前没有发现的脱靶效应。所以，这篇文章受到了不小的关注。

问：为什么此前的全基因组测序没有发现这些新产生的脱靶效应？

刘佳：虽然此前研究人员的确使用全基因组测序研究过脱靶效应，但是使用频率不如全外显子测序高。全外显子测序某种意义上可以理解为只检测编码蛋白质的序列。

这是因为全外显子测序的成本比较低，在基因编辑技术刚出现的2014 年，国内实验室要做一个全基因组测序可能需要几万元。如果一个实验室需要样本，设置不同的组，再重复几次，可能一个实验室一年的经费就没有了。

这两年，全基因组测序的成本降下来了，然后大家又对安全性格外关注，所以才会更多地考虑用全基因组测序来对编码区和非编码区同时进行测序，以此检测基因编辑的副作用。

问：这篇文章确实提到了基因编辑技术会导致一些意想不到的突变，是否会影响之前的利用相关技术研究的可靠性，提升临床试验的风险？

刘佳：从科学的严谨角度来考虑，每个研究都需要在严格界定条件的情况下才能获得有意义的结论。在基因编辑领域也是如此。实际上已经有很多实验证实，开奖，细胞类型、Cas9核酸剂量、sqRNA设计等条件会对脱靶效应等基因编辑的结果造成非常大的影响。