我们使用了原始菌里来源的和人工合成的密码子优化的NgAgo，尝试了公司合成的磷酸化gDNA和自己使用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231细胞中的laminB1和LBR基因，每个基因五条gDNA，通过T7 assay均未见切割。同时，我们切割整合在基因组的gfp基因，使用韩春雨文章所用的gDNA，流式检测也无gfp荧光的下降。我们还将NgAgo融合了荧光蛋白，使用靶向telomere的gDNA，使用高倍荧光显微镜没有发现NgAgo在telomere处的富集。

　　6 中科院动物研究所李伟课题组

　　我们在哺乳动物细胞和胚胎水平进行了基于NgAgo的基因组靶向突变实验，采用了包括韩文章中报道的293细胞和4个完全相同的guide序列和，结果均为阴性，均没有检测到靶向DNA突变产生。具体进行的实验包括：1、利用体外原核表达纯化的NgAgo和韩文章中报道的4个guide序列进行37°单链DNA切割，结果：37°没有检测到DNA切割。2、哺乳动物细胞实验。按照文章附件中的方法，在293细胞分别转染韩文章中的 G5,G10,G27,G28和自己设计的Mecp2基因guide序列，T7EI酶切检测没有检测到靶位点突变。进行guide-DNA连续转染实验，在转染后8h,12h 补充转染guide 依然没有检测到靶位点的突变。3、小鼠胚胎实验：选取Mecp2和stella 位点分别设计若干guide序列，连同NgAgo mRNA一起进行细胞质注射，收取囊胚检测，T7EI和测序分析均没有检测到靶位点突变。

　　7 中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉课题组

　　我们针对小鼠胚胎的GFP基因、Tyr基因分别设计了四个gDNA（在三家公司都试过合成了），NgAgo用了三种不同版本（密码子优化或者NLS在N端、C端），操作几百个胚胎，生了三百多只小鼠，都没有检测到敲除。之后我们又在细胞水平针对猴的Tyr基因、293的GFP基因、N2A的Tyr基因进行操作，也没有检测到任何基因编辑。最后我们完全按照韩文章中fig4的DYRKIA基因进行操作，atv，也完全没有效果。

　　8 上海交通大学吴强课题组

　　TtAgo被发现在高温下可以在体外通过gDNA指引内切单链DNA，PfAgo在高盐条件下可以切DNA单链，NgAgo可能是一种嗜盐碱古杆菌中含有类似RNaseH结构域的单链RNA内切酶，但也可能内切DNA单链。我们利用密码子优化后合成的NgAgo做了以下体内编辑实验，我们没有做体外实验：

　　1 单位点：不管是人工合成的5‘端磷酸化gDNA，还是利用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5’端羟基得到的gDNA，在小鼠胚胎、小鼠N2A细胞、人HEC-1B细胞中均没检测到活性。

　　2. 双位点：三个学生花的力气最大。至少做了三个不同的DNA片段，做了不同温度、盐离子浓度、多次转染、先体外合成NgAgo蛋白再转染、不同的Tag或核定位序列，也试了不同的细胞系。我们是用PCR检测DNA大片段敲除，这个方法很灵敏（用CRISPR/Cas9很容易做出来），因为只有在片段敲除的情况下才能扩增出PCR产物，哪怕效率很低也应该能检测出来。PCR产物经过克隆再测序，但从没有检测出片段敲除的正确结果。

　　9 温州医科大学谷峰课题组

　　我们利用携带GFP的人类细胞，同时导入磷酸化的gRNA和NgAgo表达质粒（做了多个不同浓度梯度和重复），希望特异的看GFP敲除，以CRISPR/Cas9做阳性对照，但是NgAgo组我们没有能够检测到GFP的失活。这个实验我们后面又重复了，但是仍然没有看到切割。所以此时，我们高度怀疑NgAgo的活性，该项目就先停了。

　　13位科学家实名呼吁对韩春雨启动调查：为了中国学界的名声

河北科技大学副教授韩春雨（供图：澎湃新闻）

　　撰文

　　澎湃新闻记者 王盈颖、康宁、王灿、虞涵棋

　　这是一场和时间的赛跑。这场赛跑赌上的，是中国学术界在国际上的名声。

　　一切源于2016年5月2日，河北科技大学副教授韩春雨课题组在国际顶级期刊《自然-生物技术》上发表了NgAgo基因编辑技术的论文。刚发表时，NgAgo被认为是新一代基因编辑工具，可媲美此前有“基因魔剪”美称的CRISPR技术，被国内部分媒体誉为“诺奖级”学术成果。 然而，之后的故事急转直下，全球数百家实验室，历时5个月的时间，没有一家宣布能重复成功。质疑声越来越大，韩春雨不作正面回应，却收获接连的荣誉：河北科协副主席、美丽河北最美教师、100万元国家自然基金......受惠于NgAgo技术，河北科大获得了河北发改委2.24亿元的财政拨款，用于建设河北科技大学基因编辑技术研究中心。