MP培养费时费力而且价格不菲，期间需要配制特殊而昂贵的培养基、并需经过多次盲传以及长达数周的孵育时间，因此临床实验室开展不多。与分子生物学方法如PCR相比，即使在非常有经验的实验室，培养方法的敏感性不超过60%。但是，MP培养阳性的诊断特异性接近100%，并能对分离株进行菌种鉴定、分型及药敏实验，故仍具有重要的临床意义。

　　1．标本类型和采集：

　　理想条件下，源于呼吸道任何部位的标本均可进行肺炎支原体的分离培养，包括鼻咽和咽喉拭子、痰、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液、气管吸取物及肺组织。如果是拭子，需在标本采集时多加用力旋转以获得尽可能多的上皮细胞。推荐使用铝制或塑料杆的藻酸钙、涤纶和聚酯拭子。木杆拭子可能对支原体生长有潜在抑制作用应尽量避免使用。

　　2．标本运送和贮存：

　　MP对外界环境非常敏感，尤其是干燥和高温。标本应尽可能在床旁接种于适当的运送培养基或支原体培养基。运送培养基可直接使用SP4培养基，也可使用2SP(10%热灭活小牛血清＋0.2 mol/L蔗糖，配成0.02 mol/L磷酸盐缓冲液)或胰蛋白酶大豆肉汤加0.5%胎牛血清。无论采用何种运送培养基，如果是从非无菌部位采集的标本如咽拭子，必须加入抗生素或其开奖直播抑菌剂防止细菌污染。液体标本或组织如能在1 h接种则不需要特殊运送培养基。组织标本可置于无菌容器中立即送至实验室，否则仍需放于运送培养基内。如果标本不能迅速送至实验室则应冻存，以防止支原体活力丧失。24 h不能接种者应于–70 ℃冻存。支原体标本在–70 ℃或液氮环境下置于适当的生长培养基或运送培养基中可长期保存。冻存的标本接种前应迅速置于37 ℃水浴预热。

　　3．培养方法：

　　为了提高临床标本中肺炎支原体检出率，可在接种标本后将液体培养基浓度自10–1梯度稀释至10–3，并同时接种固体培养基。梯度递减稀释法可以减少某些内在抑制物影响。组织接种前需切碎。MP专用培养基中必须含有葡萄糖作为代谢底物，同时还应包括血清(作为胆固醇来源)、酵母提取物以及pH显色剂。推荐使用SP4肉汤及琼脂培养基进行MP培养。对于呼吸道标本而言，如果仅培养MP则接种一种选择培养基如SP4即可，可采用液体-固体法或双相培养基。液体培养基应置于37 ℃空气环境中，固体培养基在含有5%～10% CO2的空气条件下生长最佳。

　　4．液体培养结果判读和传代：

　　MP孵育培养的时间从4 d至数周不等，最佳生长期可能需要21 d或更长。在液体培养基中，由于MP分解葡萄糖产酸使酚红显色剂变为黄色。但细菌生长也利用葡萄糖产酸使培养基变色，需加以鉴别，细菌污染时培养基多呈混浊。所有变色液体培养基需要传代至新鲜液体(0.1 ml接种至0.9 ml)和固体(0.02 ml接种)培养基中。传代培养必须在变色后及时进行，一方面减少对菌种活力影响，另一方面因为有些菌株在原代培养液中生长不佳，及时传代可以增加培养的阳性率。在培养过程中不断盲传对MP这类生长缓慢、变色不明显的支原体而言能够提高阳性率。至少培养6周无变化才能认为是阴性结果。

　　5．固体培养：

　　应每3～5天利用显微镜观察固体培养基，要正确鉴别支原体菌落与其开奖直播人工产物，如气泡、水滴、脂粒或碎片。初次分离的MP菌落多呈圆形、隆起，如水滴状，无外晕。多次传代后可呈典型煎蛋状。有菌落生长的培养基可将琼脂小块切下转入液体培养基继续孵育纯化，变色后用以保存菌株。

　　6．鉴定：

　　如果接种临床呼吸道标本的SP4液体培养基变色，且固体培养基上出现缓慢生长圆形菌落，应考虑MP可能，进一步可采用血清学和PCR方法明确。

　　四、体外药物敏感性试验

　　美国临床与实验室标准委员会(CLSI)2011年颁布了支原体体外药敏测定的指南，微量稀释法被推荐用于MP最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)测定。以下作简单介绍：首先需测定MP菌落计数。将培养液每管分装0.9 ml，吸取对应的阳性菌液0.1 ml加入其中，混匀后吸取0.1 ml至第二管，如此顺序作6倍递增稀释10–1～10–6，每个稀释度取20 μl接种固体平板，37 ℃孵育。显微镜下计数平板上的菌落，并计算获得临床分离株的菌落计数。MIC值测定：接种菌落计数为104～105/ml，在96孔板中采用微量稀释法测定，同时设置阴性对照(仅培养液)、阳性对照(无抗生素菌液培养)及质控菌对照孔，无菌石蜡油封孔后置37 ℃，一定湿度下孵育。培养至阳性对照生长时记录MIC值。判断标准(MIC值)：左氧氟沙星≤1 μg/ml、莫西沙星、红霉素及阿奇霉素≤0.5 μg/ml，四环素≤ 2 μg/ml评定为敏感；红霉素及阿奇霉素> 1 μg/ml评定为耐药，目前未发现体内对喹诺酮类及四环素耐药的MP临床株。

　　参考文献（略）